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微流體Drop-Seq液滴測序/單細胞測序
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微流體Drop-Seq液滴測序/單細胞測序

細胞是生物結構和功能的基本單元,在類型和狀態上有很大差異。在大多數生物系統中,我們對細胞多樣性的認識是不完整的,就像神經系統(腦細胞)這樣的復雜組織[1]。單細胞識別和功能的表征,作為對每個細胞的功能和反應的理解,將加速生物領域的發現。它可能是癌癥、腫瘤,幾何任何可能在細胞群中具有多樣性的東西。然而,今天的技術并不能提供一種簡單的方法來同時分析大量的單個細胞?焖、可擴展的液滴測序(Drop-Seq)這種方法可以用來表征具有許多細胞類型和狀態的復雜組織。


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Drop-Seq的原理和好處
Drop-Seq是一種基于使用微流體技術的方法,通過將它們封裝在微小液滴中進行平行分析,可以快速分析數千個單個細胞。

這些納升級水性隔離室已用于微流體器件中的許多應用:納米顆粒制造、乳液和泡沫、藥物輸送,但也作為PCR和逆轉錄的微小反應室[3]。Drop-Seq使用液滴將細胞分隔成納升大小的反應室,用于分析其mRNA轉錄物,同時使用分子條形碼策略記住轉錄物的起源細胞。通過這種技術,一個科學家每天可以制作10000個單細胞庫,實驗并行進行且簡單。因此,該方法將允許為已知細胞類別和新的候選細胞亞型產生基因表達的分子圖譜。

Drop-Seq利用微流體的優勢

(1)很短的時間內有很高的吞吐量

(2)盡量減少昂貴樣品的消耗


Drop-Seq包含以下步驟

1. 從組織中制備單細胞懸浮液
2. 準備條形碼引物(或者在微顆粒表面或者在內部)
3. 使用微流體裝置將每個細胞單獨地與一個微小條紋的微粒共同包覆或封裝在一個微小的液滴中
4. 一旦分離成液滴,裂解細胞,釋放它們的mRNA,然后與引物(primers)雜交。
5. 打破液滴并產生STAMP(附著于微粒的單細胞轉錄組)
6. 放大STAMP
7. 測試和分析:使用STAMP條形碼推斷每個轉錄物的起源細胞


Drop-Seq可以使用2種beads:
A:“簡單”的微粒
B:水凝膠微粒


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該項工作的重點是“簡單”微粒的使用,并簡要介紹了水凝膠微粒,其原理保持不變。


Drop-Seq使用簡單的微粒
1. 從復雜的組織中準備單細胞懸浮液
將復雜組織解離成單個細胞


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2. 引物(primer)合成
微粒上的引物序列
每個微粒包含超過108個單獨的引物,它們共享相同的“PCR句柄(PCR handle)”和“細胞條形碼(cell barcode)”,但具有不同的獨特分子標識符(UMI)。事實上,PCR句柄在所有引物和beads上具有相同的恒定的序列,這允許在STAMP形成后進行PCR擴增。細胞條形碼,僅在相同微粒的所有引物上相同但與其他beads上的細胞條形碼不同,允許回復細胞的起源。每種引物上不同的UMI允許對mRNA轉錄物進行數字計數并鑒定PCR duplicates。最后,在所有引物序列的末端存在30bp的oligodT序列,用于捕獲mRNA并引發逆轉錄。


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細胞條形碼的分裂和池合成(split-and-pool synthesis)
為了產生細胞條形碼,將微粒庫重復分成四個大小相等的寡核苷酸合成反應,向其中加入四個DNA堿基中的一個。然后,在每個循環后將微粒合并在一起,并進行總共12次分裂-池循環(split-pool cycles)。結果是一個微粒庫,每個微粒具有4^12(16,777,216)個可能的DNA堿基序列之一。[4]


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合成獨特的分子標識符(UMI)
UMI的合成在“分裂-池(split-and-pool)”合成循環完成后進行。將所有微粒一起進行八輪簡并合成,每個循環期間可獲得所有四種DNA堿基,使得每個單獨的引物接受4^8(65,536)種可能序列(UMI)中的一種。[5]


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3. 微流體裝置
一旦單細胞懸浮液和微粒準備就緒,使用定制設計的微流體裝置將單個細胞與微粒一起包覆在液滴中。


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Image courtesy of Patrick Stumpf, Matthew Rose-Zerilli, Rosanna Smith, Martin Fischlechner & Jonathan West at the Centre for Hybrid Biodevices & Cancer Sciences Unit at the University of Southampton


該裝置在它們分成離散的液滴之前連接兩路水相。層流防止在液滴形成之前混合兩種水相輸入,一路流相包含細胞,另一路流相包含懸浮在裂解緩沖液中的條形碼引物beads。


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微流體裝置
組件列表
(1)倒置顯微鏡
(2)壓力控制器+3流量傳感器/三個注射泵
(3)3個falcon管/3mL注射器
(4)磁力攪拌系統
(5)用于實驗裝置元件連接的微流體導管
(6)微流體配件和連接器
(7)PDMS共流微流體液滴生成裝置
(8)用于beads的100微米細胞過濾器
(9)用于細胞的40微米細胞過濾器
(10)計數室

實驗裝置連接示意圖

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4. 細胞裂解和RNA雜交
在液滴形成后,立即將每個細胞在液滴內裂解并釋放其mRNA。然后,它們與其伴隨的微粒表面上的引物雜交。


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5. STAMPS產生
為了一次有效地產生數千個STAMP,通過添加試劑來破壞液滴以使油-水界面不穩定,并收集和洗滌微粒。然后將mRNA在一個反應中一起逆轉錄成cDNA,形成一組稱為“附著于微粒的單細胞轉錄組(STAMPs)”的beads[6]。


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6. STAMPS的放大
然后可以通過PCR反應在池(pools)中擴增條形碼化的STAMP,用于高通量mRNA測序,以分析任何所需數量的單個細胞。


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7. 測序和分析
使用高容量平行測序對每個末端對得到的分子進行測序。首先,將讀數與參考基因組比對以鑒定cDNA的起源基因。接下來,通過細胞條形碼組織讀數,并且對每個細胞中確定的每個基因的mRNA轉錄物的數量進行數字計數。這是UMI發揮作用的地方,避免從同一mRNA轉錄物中重復計數序列讀數。隨后,可以建立數字基因表達測量矩陣(每個細胞每個基因一個測量)用于進一步的分析。


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使用水凝膠微球的Drop-Seq測序
關于水凝膠beads的使用,操作原理或多或少與以上保持相同,即最大的區別在于引物(primers),它們位于微粒內而不是位于它們的表面上。


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為此,微流體裝置由三個通道而不是兩個通道組成:
(1)帶beads的一個通道(最關鍵的部分)
(2)把細胞帶入液滴的一個通道
(3)帶來我們需要進行分析的化學試劑的一個通道

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至于“簡單微粒(simple microparticles)”的使用,水凝膠beads含有可用于逆轉錄反應的引物,然后隨后對液滴內的細胞內容物進行條形碼編碼,由此獲得作為RNA序列的拷貝的DNA序列的集合,并且現在通過它們來自哪一個液滴來對這些序列進行分類。

然后,可以打破液滴并將整個細胞群作為大量樣品處理,知道每個細胞已被單獨編碼。


參考論文
[1] L. Luo et al., Genetic Dissection of Neural Circuits.
[2] B. J. Hindson et al., High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.
[3] N. R. Beer et al., On-Chip Single-Copy Real-Time Reverse-Transcription PCR in Isolated Picoliter Droplets.
[4-6] Macosko et al., Highly Parallel Genome-Wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.


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