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P4SPR表面等離子體共振分析儀檢測脂質體

脂質體是由同心磷脂雙分子層組成的磷脂囊泡,這些雙分子層包圍起來形成一個水性空間[1](圖1所示)。磷脂尾由兩條疏水的長脂肪酸鏈組成,它們聚集在一起以最大限度地減少與水分子的相互作用,即疏水作用。脂質體在藥物遞送領域具有重要的意義,因為其無毒、生物相容性和可生物降解。最重要的是,它們可以通過將藥物插入雙層的疏水部分或脂質體的水性內部來遞送藥物[2]。此外,脂質體可以保護藥物不被酶降解和被腎臟過濾掉[2]。


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圖1 脂質體的結構和修飾以將藥物輸送到特定細胞


為了將脂質體輸送到特定類型的細胞,脂質體需要用抗體、配體[2]或其他蛋白質或肽進行修飾,如圖1所示。一旦修飾的脂質體被靶細胞上的特定受體識別,它們就會在稱為受體介導的內吞作用的過程中被細胞吸收(圖2),從而將藥物分子輸送到細胞質中[3, 4]。例如,葉酸(一種配體)及其結合受體葉酸結合蛋白(FBP)通常用于研究癌癥研究中的藥物遞送策略,因為FBP在多種人類癌癥中過度表達,例如卵巢癌、腦癌、腎和肺[3, 4]。


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圖2 配體修飾脂質體的受體介導的內吞作用。第一個脂質體被放大以清楚地顯示配體。在典型的細胞膜上可以看到配體的受體。配體與受體結合后,細胞膜在脂質體周圍閉合形成囊泡,將攜帶藥物的脂質體捕獲在其中,然后在細胞內進一步加工以將藥物釋放到細胞質中。


聚乙二醇(PEG)是眾所周知的一種物質,通常用于防止蛋白質的表面吸附[5]。對于脂質體的應用,通常添加PEG以延長脂質體在人體內的循環時間,因為沒有它,未修飾的脂質體將在幾小時內被參與免疫反應的吞噬細胞清楚[2, 3]。這是因為PEG的存在阻止了吞噬細胞的非特異性吸附,例如[3]。然而,用PEG修飾脂質體的缺點是由于空間位阻,它可能會降低脂質體上的配體與其特異性受體結合的能力。因此,必須在延長脂質體循環時間和最大化脂質體向靶細胞的遞送效率之間進行折衷[2]。


脂質體已固定在表面等離子共振(SPR)傳感表面上以研究藥物和脂質體的相互作用[6],并作為一種放大策略來降低干擾素和細菌毒素的檢測限,例如[7]。以下實驗的目的是證明向葉酸修飾脂質體中添加PEG2000會導致與固定在Affinite P4SPR的SPR金傳感表面上的FBP的結合降低(圖3)。SPR是一種強大的工具,可以實時、無標記地表征修飾的脂質體。此外,實驗室內使用P4SPR儀器可以讓研究人員即時執行實驗優化,而不是多次使用公共測試中心的設備進行反復測量,這節省了大量的寶貴時間。


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圖3 使用Affinite的P4SPR檢測聚乙二醇化和非聚乙二醇化葉酸修飾脂質體的方案


實驗步驟

使用P4SPR在靜態條件下測量SPR。為了固定葉酸受體,通過在MilliQ水中注射500 μL的EDC:NHS 20:5mM來激活16-MHA涂層的金棱鏡,并反應20分鐘。通過注入1mL 100mM磷酸鹽緩沖液徹底清洗表面。然后,在由100mM磷酸鹽緩沖液(pH=5)、4mM巰基乙醇和10% v/v 甘油組成的緩沖液中注入300 μL 40nM葉酸結合蛋白(FBP)并反應1小時。FBP固定后,表面用1mL 100mM磷酸鹽緩沖液沖洗,以評估生物傳感器表面吸附的FBP。注入1mL 1M乙醇胺并反應5min以滅活未反應的NHS基團。傳感器用1mL 1×PBS(pH=7.4)沖洗,并注入500μL脂質體樣品。所有脂質體懸浮液的濃度為10μM,并固定10min。注入的樣品列于表1中,區別僅在于在第二個樣品中添加了DOPE-PEG 2000-NH2。在脂質體固定期間,依次用 1 mL 1 x PBS (pH=7.4) 和 1 mL 10 mM 甘氨酸 (pH=1.5) 沖洗表面 5min,最后用 1 x PBS (pH=7.4)沖洗。


表1

Sample

Mol % DSPE-PEG-Folate

Mol % DOPE-PEG 2000-NH2

1

0.5

0

2

0.5

3.5


結果

圖4顯示了一組初步檢測結果,其中顯示了每個樣品的傳感圖(sensorgrams)。首先,數據顯示P4SPR能夠通過葉酸和FBP結合親和力檢測脂質體,如從~60s到~750s(綠色)和~60s和~800s(黑色)的兩條關聯曲線所示)。此外,可以看到,與未聚乙二醇化的葉酸修飾脂質體樣品(~110RU,黑色)相比,聚乙二醇化葉酸修飾的脂質體樣品(綠色)的共振單位相對變化(~40RU)較低。這表明脂質體表面PEG的存在因為空間位阻而抑制了葉酸修飾脂質體與FBP修飾傳感器表面的一些結合,即PEG阻止脂質體上的葉酸與固定在傳感器表面上的FBP的結合。


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圖4 顯示了每個脂質體樣品獲得共振單位的部分傳感圖


從傳感器表面的表面活化和葉酸修飾到脂質體樣品的最終注射,該實驗大約需要3小時才能完成?係PR運行時間可能更短,因為在初始進樣和最終進樣之間進行了一些樣品濃度優化。研究人員可以隨時更改實驗條件這一事實是在實驗室內擁有P4SPR儀器的優勢。最后,即使觀察到注射尖峰并且可以優化表面化學和脂質體濃度等其他條件,您可以隨時在P4SPR上重復和進一步開發實驗。


結論

Affinite P4SPR能夠檢測葉酸修飾的脂質體,更重要的是,由于PEG引起的空間位阻,可以區分PEG和未聚乙二醇化的葉酸修飾脂質體之間的差異,從而降低葉酸對FBP的親和力。Affinite P4SPR儀器可用作研究人員的標準檢測平臺,在進行生物測定或動物實驗的進一步測試之前,以快速簡單的方式表征脂質體以獲得藥代動力學特征[8],從而避免浪費寶貴的研究時間、資源和動物。最重要的是,因為不需要使用公共測試中心的SPR儀器,P4SPR儀器觸手可及的加速了脂質體的研究開發,


致謝

我們感謝 Félix Lussier 博士提供傳感圖數據。 Félix Lussier 博士來自Max Planck Institute醫學研究所細胞生物物理學系。


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參考文獻

[1] Parveen Kumar, Peipei Huo, and Bo Liu, “Formulation Strategies for Folate-Targeted Liposomes and Their Biomedical Applications”, Pharmaceutics, 11, 381 (2019).

[2] Robert J. Lee and Philip S. Low, “Delivery of Liposomes into Cultured KB Cells via Folate Receptor-mediated Endocytosis”, J. Biol. Chem., 269, 3198-3204 (1994).

[3] Alberto Gabizon, Aviva T. Horowitz, Dorit Goren, Dina Tzemach, Hilary Shmeeda, and Samuel Zalipsky, “In Vivo Fate of Folate-Targeted Polyethylene-Glycol Liposomes in Tumor-Bearing Mice”, Clin. Cancer Res., 9, 6551–6559 (2003).

[4] Mary Jo Turk, David J. Waters, Philip S. Low, “Folate-conjugated liposomes preferentially target macrophages associated with ovarian carcinoma”, Cancer Lett., 213, 165-172 (2004).

[5] Roger Michel, Stephanie Pasche, Marcus Textor, and David G. Castner, ”The Influence of PEG Architecture on Protein Adsorption and Conformation”, Langmuir, 21, 12327-12332 (2005).

[6] Cheryl L. Baird, Elizabeth S. Courtenay, and David G. Myszka, “Surface plasmon resonance characterization of drug/liposome interactions”, Anal. Biochem., 310, 93-99 (2002).

[7] Agustina Gomez-Hens, Juan Manuel Fernandez-Romero, “The role of liposomes in analytical processes”, Trends Analyt. Chem., 24, 9-19 (2005).

[8] B.J. Crielaard, A. Yousefi, J.P. Schillemans, C. Vermehren, K. Buyens, K. Braeckmans, T. Lammers, G. Storm, “An in vitro assay based on surface plasmon resonance to predict the in vivo circulation kinetics of liposomes”, J. Control. Release, 156, 307-314 (2011).



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